安捷倫液相色譜儀測定小麥中內(nèi)源激素
植物激素對植物的種子萌發(fā)、生長、開花、成熟、衰老、休眠等生命活動起直接或間接的調(diào)節(jié)、控制作用。小麥是我國三大農(nóng)作物之一,如 何 調(diào) 控 其生長發(fā)育,進而促 進 分 蘗,提高產(chǎn)量和品質(zhì),備 受 農(nóng)業(yè)科研 人 員 的 關 注。了解小麥內(nèi)源激素的變化規(guī)律,對于研究其產(chǎn)量和抗性等具有重要的生產(chǎn)實踐價值。
本文研究對小麥中的IAA、ABA、GA3、ZT、SA進 行 分 離 和 測 定,建立一種分析小 麥 激 素 的 有 效 方 法,從 而 為 小 麥 內(nèi)源激素調(diào)節(jié)和控 制 小 麥 的 生 長、衰老等研究提供關鍵技術。
1實驗部分
1.1儀器與試劑
Agilent1200高 效 液 相 色 譜 儀,Agilent1200系列泵,可變波長檢 測 器,TU1810紫外可見分光光度計,RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā) 儀,320-SpH計,HR-120電 子 天 平,KQ500DE型 超 聲 波 脫 氣,BeckmanAllegra64R冷凍離心機。
玉米素、赤霉素、生長素、脫落酸、水楊酸標準品(純 度≥99%),甲 醇、乙 酸(色 譜級),石 油 醚、乙 酸 乙 酯(分 析 純,國 藥 集團化學試劑有限公司),實驗用水為超純水。所有試劑在使用前均用0.45μm微孔濾膜過濾。
1. 2標準溶液的配制
用甲醇配制0.2g/L生 長 素、0.1g/L玉 米 素、0.1g/L脫落酸、2.5g/L赤霉素、0.4g/L水楊酸的混合標準溶液。
1. 3樣品前處理
稱取新鮮小麥葉2g、根5g,分別加入10mL預冷的80%(如無特殊說 明 均 為 體 積分 數(shù))甲 醇,冰浴研磨成漿,保鮮 膜 密 封 后 于4°C冷 浸 過 夜。然 后于4°C條 件 下以8000r/min離 心10min得 上 清液,殘渣加入8mL80%的 冷 甲 醇 離 心10min后 合并上清液。全部濾 液 于40°C下減壓濃縮至原體積的1/3,加 入30mL石油 醚 萃 取 脫 色3次,棄 醚 相。水相用20mL乙酸乙 酯 萃 ?。炒危?nbsp;并 酯 相,40°C下減 壓 蒸 干。加 入pH3.5的 乙 酸 溶 液2mL,過Sep-PakC18小柱純化,用甲醇洗脫,收集后在40°C下減壓濃縮至干。用流動相溶解并定容至2mL,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進行HPLC分析。
1. 4色譜條件色
譜 柱 為EclipseXDB-C18(250mm×4.6mm,5μm,Agilent公 司),流 動 相A為 甲 醇,B為乙 酸 的 水 溶 液(pH3.6),梯 度 條 件 為0~7min20%A,7~10min20%A~28%A,10~17min28%A,17~19min28%A~40%A,19~35min40%A。流 速 為1mL/min,進 樣 量 為10μL。檢測 器 波 長 設 置 為254nm;14.5min時 切 換 到240nm;SA洗脫 后 即18min時 切 換 回254nm。檢測溫度為室溫。
2結果與討論
2. 1樣品處理條件的優(yōu)化
由于水楊酸含量低且易被PVPP吸附,選擇Sep-PakC18小 柱 純 化。對5種激素提取效果良好。
2.2色譜條件的選擇
2.2.1流動相梯度
綜 合 考 慮 各 激素分離度、峰形的對稱性以及縮短分析時間,zui終采用1.4節(jié)所述的梯度洗脫條件。
2.2.2流動相的pH
選 擇pH3.6的 乙酸的水溶液為 流 動 相B,各峰的分離度以及保留時間都較好。
2.2.3檢測波長
選 擇 在SA出 峰 前(14.5min)將檢測器波長 切 換 到240nm,待 出 峰 *結束后(18min)切回254nm(圖1b)。切 換 波 長 更 利于 待 測 組 分 的 分析 檢 測。
2.2.4流速
流 速 為1mL/min時,各激素能在35min內(nèi)很好的分離。在優(yōu)化的色 譜 條 件下,對混合的標準樣品進行檢測。5種 激 素 能 夠 較 好 地 分離和檢出。
2.3標準曲線及其線性范圍
以5種激素的標準溶液為原液進行逐級稀釋,在優(yōu) 化 的 色 譜 條 件 下 分 析。以峰面積為縱坐標(y),質(zhì)量濃度 為 橫 坐 標(x,mg/L),計 算 各 內(nèi) 源 激素的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍,同時按3倍信噪比得到 各 激 素 檢 出 限(見 表1)。由 結 果 可 知,標準品濃度與峰面積的相關性良好。
2. 4回收率的測定和實際樣品分析
取小麥根樣品2g,按照1.3節(jié)方法制備樣品并用上述條件進行 測 定。如 圖3所 示,小麥 根 中 的 激素能得到很好 的 分 離。隨 后 進 行 加 標 回 收 試 驗,結果見表2。
3結論
通過優(yōu)化小麥中5種內(nèi)源激素的提取條件以及色譜條件,建立了一種簡單、有效的液相色譜分析方法。分離效果理想,加 標 回 收 率 達96%~98%,檢出限為0.195~0.976mg/L。方法滿足激素 定 量分析的測定要求,為進一步檢測小麥生長過程中內(nèi)源激素的變化、激素代謝與小麥的生長、衰老等相關性研究提供了關鍵技術。